Идентификация и контроль происхождения лошадей
по генетическим маркерам

Метод контроля происхождения лошадей по генетическим маркерам уже широко практикуется во всех странах с развитым коннозаводством и практически является обязательным элементом первичного зоотехнического учета. Благодаря открытию наследственного полиморфизма белков, групп крови лошадей в 70-80-х годах прошлого века, а в последнее десятилетие и микросателлитов ДНК, появилась возможность надежной генетической идентификации каждого животного и достижения максимальной эффективность контроля происхождения.

Зав. лабораторией генетики
кандидат с/х наук
Храброва Людмила Александровна

В соответствие с Федеральным законом о племенном животноводстве (1995) и положениями о Государственных племенных книгах (ГПК) обязательному тестированию и контролю происхождения подлежат все племенные лошади заводских пород. Выдача племенных паспортов и запись в ГПК  производится на основании заключения лаборатории генетики.

Лаборатория иммуногенетики ВНИИ коневодства была организована в 1979 году и в настоящее время является аккредитированным органом генетической сертификации племенных лошадей. За годы работы в лаборатории накоплена картотека генотипов более 100 тысяч лошадей разных пород, что позволяет не только проводить контроль происхождения животных, но и в необходимых случаях уточнять отцовство и идентифицировать лошадей.

С 1983 года ВНИИ коневодства является членом Международного общества генетики животных (ISAG)  и регулярно принимает участие в международных сравнительных испытаниях по тестированию систем крови и ДНК лошадей. В конце 2006 года лаборатория была оснащена современным оборудованием фирмы Applied Biosystems, включая 4-х капиллярный генетический анализатор ABI 3130, и приступила к тестированию лошадей по 17 локусам микросателлитов ДНК.

В настоящее время, в соответствии с рекомендациями ISAG и требованием Международного комитета по племенным книгам (ISBC), большинство лабораторий, занимающихся тестированием лошадей, полностью переходит на типирование по ДНК. И это обусловлено не только правилами обязательного типирования по ДНК лошадей чистокровной верховой и арабской пород, но и высокой эффективностью и экономичностью данного метода. Надежность проведения генетической экспертизы происхождения и уточнения отцовства у лошадей чистокровной верховой по 12-ти микросателлитным локусам ДНК достигает 99,9% и более.

Практика показывает, что неправильные записи в родословных обусловлены самыми разными причинами: плохим первичным учетом, покрытием кобылы двумя и более жеребцами, внешним сходством животных, не исключена возможность и умышленной фальсификации с целью повышения кровности или стоимости лошадей. Поэтому не случайно Международным комитетом по племенным книгам (ISBC) было выдвинуто требование генотипирования чистокровных верховых лошадей по микросателлитам ДНК, чтобы окончательно решить проблему надежности идентификации и контроля происхождения.

Генетическая экспертиза происхождения лошадей по микросателлитам ДНК имеет ряд преимуществ, главное из которых - высокая эффективность, близкая к 100%. Рекомендуемые для генетической экспертизы локусы микросателлитов распределены по всему геному и характеризуются сравнительно высоким уровнем полиморфности, т.е. числом распространенных аллелей. Высокая информативность микросателлитных локусов позволяет успешно использовать их в качестве генетических маркеров для решения широкого круга селекционных задач, включая определение степени гомозиготности, генетического родства по мужской и женской линии, оценки уровня внутрипородной генеалогической дифференциации, а также прогнозирования работоспособности и плодовитости. Для владельцев лошадей и специалистов удобно, что для проведения ДНК-анализа требуется очень небольшое количество биологической ткани, включая кровь, волосяные луковицы, сперму и т.д., при этом выделенная ДНК может годами храниться в замороженном состоянии.

При генетической экспертизе происхождения лошадей используют преимущественно микросателлиты ДНК, которые представляют собой сравнительно короткие повторяющиеся участки динуклеотидных блоков. Именно разработка методики типирования микросателлитных локусов в конце 80-х годов определила последующие успехи в изучении генома человека и животных. На сегодня у лошади уже определена локализиция более 300 микросателлитных локусов и частично картированы все 32 пары хромосом.

Количество динуклеотидных тандемных блоков ДНК у разных организмов, как правило, строго индивидуально и наследуется в соответствии с законами Менделя. Весомым преимуществом микросателлитных локусов является большое число аллелей (в среднем 6-8 на локус) и кодоминантный характер наследования, позволяющий четко отделять гомозиготу от гетерозиготы и контролировать гены, полученные от родителей. С практической точки зрения микросателлиты являются идеальными генетическими маркерами и могут быть использованы для решения ряда стратегических задач селекции.

Современная технология типирования лошадей по ДНК маркерам базируется на  использовании фирменного лабораторного оборудования (Applied Biosystems) и специфического набора праймеров для типирования ДНК лошадей (StockMarks). Использование автоматизированного оборудования позволяет проводить генотипирование проб в автоматическом режиме сразу по 17-ти микросателлитным локусам и получать результаты, сопоставимые с данными других лабораторий.

В задачу экспертов входит несколько операций: выделение ДНК из представленного материала (крови или волосяных луковиц) и подготовка проб для анализа; их амплификация с набором праймеров с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), денатурация ДНК, проведение электрофореза на генетическом анализаторе и интерпретация полученных результатов. При амплификации ДНК со специальным набором праймеров (которые выполняют функцию генетического шаблона) происходит процесс “отбора” и многократного увеличения нужных участков хромосом. Программное обеспечение ДНК-анализатора позволяет визуализировать процесс лазерной детекции продуктов электрофореза в виде разноцветных графических профилей и выдает на экране монитора результаты генотипирования проб в виде графика аллельных пиков, представленных на рисунке. На заключительном этапе проводится интерпретация полученных результатов, т.е. определение генотипа лошади и проверяется его соответствие указанным родителям.

 Рис. 1. Семейный анализ по локусам микросателлитов ДНК

 Контроль происхождения лошадей по генетическим маркерам, к которым относятся полиморфным системы белков, группы крови, а также и микросателлиты ДНК, основан на принципе генетического исключения. В соответствии с законами генетики набор генов потомка должен соответствовать генотипам его родителей (так как половина хромосом передается от отца и половина от матери). Следовательно, приплод не может получить и иметь гены, которые отсутствуют у его родителей. Поэтому при генетической экспертизе происхождения на основании установленных у родителей генетических маркеров (типов белков, микросателлитов ДНК) проверяется возможность наличия у лошади протестированного генотипа (т.е. унаследованной пары генов) по каждому из исследуемых локусов. Выявление у потомка “левых” аллелей явно свидетельствует о несоответствии записей о происхождении. Если у жеребенка “не проявляются” аллели отца, делается закономерный вывод о ложном отцовстве. А вот случаи, когда не подтверждается материнский генотип, часто бывают следствием “перепутывания” похожих лошадей в хозяйстве или при транспортировке.

При контроле происхождения лошадей обязательно учитывают генетические особенности пород, наличие у них тех или иных аллелей. Так, например, в результате закрытой системы ведения студбука и интенсивной селекции по работоспособности аллелофонд чистокровной верховой породы оказался довольно консолидированным, и у лошадей этой породы отсутствуют многие аллели микросателлитов ДНК (также как белков, ферментов и групп крови), встречающиеся у полукровных пород.

Владельцев лошадей нередко интересует вопрос, можно ли по крови (или результатам типирования) определить породу или происхождение лошади. Ученые пока еще не выявили породоспецифических маркеров у лошадей, но особенности аллелофонда зарубежных и отечественных пород хорошо изучены и могут быть полезны при определении породной принадлежности. При типировании лошадей арабской породы по микросателлитам ДНК было выявлено около двух десятков дополнительных аллелей, не встречающихся у чистокровных верховых лошадей, а спектр генов изученных локусов у ахалтекинцев оказался еще более разнообразным. Ряд уникальных аллелей микросателлитных локусов был обнаружен у алтайской, башкирской, забайкальской и мезенской.

Для анализа ДНК можно использовать кровь, волосяные луковицы, сперму, слюну и любой другой биологический материал, содержащий хотя бы несколько клеток. Владельцы лошадей явно отдают предпочтение более простому и экономичному методу сбора волосяных “выщипов”, но и эту операцию надо делать правильно.

Для проведения генетической экспертизы по ДНК в лабораторию необходимо доставить 4-5 мл цельной крови, взятой с антикоагулянтом, как и на иммуногенетическое тестирование. В качестве антикоагулянта лучше использовать сухой Трилон Б и лимоннокислый натрий из расчета 35-50 мг на пробирку. Гепарин добавлять не рекомендуется, так как он может оказывать негативное влияние на генотипирование ДНК. При заборе проб крови удобно использовать специальные разовые комплекты для взятия крови (типа BD Vacutainer), состоящие из вакуумной пробирки с антикоагулянтом, стерильной иглы и держателя для пробирки. Пробы крови хранят и транспортируют при низких положительных температурах в течение 3-х суток с момента взятия.

Отбор волосяных луковиц, является наиболее простой процедурой, при этом их можно хранить длительное время в обычных условиях, но обязательно в сухом и темном месте. Свет разрушает цепочки ДНК, поэтому при отправке по почте конверты с образцами волос нужно упаковывать в плотную бумагу или пакет.

При взятии проб волосы и поверхность кожи в зоне гривы обрабатывают спиртом, после чего проводится аккуратное выдергивание волос. Необходимо следить, чтобы на концах взятых волос оставались волосяные луковицы, потому что именно они используются для анализа. От одной лошади необходимо выдернуть не менее 30-40 волос с луковицами. Не следует использовать для взятия и хранения проб полиэтиленовые пакеты, в которых обычно скапливается влага и могут поселяться бактерии и грибки. Нужно защищать волосяные луковицы от света, который разрушает ДНК.

Владельцам следует обратить внимание на правильное оформление сопроводительных документов: для оформления документации и результатов генетической экспертизы это имеет немаловажное значение. Список лошадей для генетического тестирования должен включать номера пробирок с образцами крови или конвертов с волосом и всю необходимую информацию о лошади: порода, пол, кличка, масть, год и место рождения, номер ГПК и клички родителей. Лаборатория проводит тестирование проб только после предварительной оплаты экспертизы. По результатам типирования ДНК лошади лаборатория выдает международный генетический сертификат.

Сегодня лаборатория генетики  оказывает владельцам следующие виды услуг:
 

 - Проведение контроля происхождения лошадей по системам крови и ДНК;

- Оформление международного ДНК-сертификата;

- Уточнение происхождения лошади;

- Проведение экспертизы происхождения в спорных случаях;

- Оценка гетерозиготности и породной типичности;

-  Тестирование лошадей по генетическим мутациям  СSID (комбинированный иммунодефицит), HYPP (периодический паралич), консультации по предупреждению наследственных дефектов;

- Скрининг  Babesia equi  и микробной контаминации спермы методом ПЦР.

Расценки на генетическое тестирование и контроль
происхождения лошадей на 01.01. 2009:

на главную

наверх